Химическое строение гена.
Исследования, направленные на выяснение химического строения наследственного материала, доказали, что материальным субстратом наследственности и изменчивости являются нуклеиновые кислот. Нуклеиновые кислоты являются макромолекулами и отличаются большой молекулярной массой. Это полимеры, состоящие из нуклеотидов, включающих три компонента: сахар (пентозу), фосфат и азотистое основание.
Свойства генов:
Гены контролируют определённые ферментативные реакции.
Гены могут мутировать. Мутон – это минимальная единица мутирования. Может состоять из одной пары нуклеотидов.
Ген может рекомбинировать. Рекон – единица рекомбинации. Минимальный размер рекона – две пары нуклеотидов.
Дискретность.
Плейотропность – один ген отвечает за развитие нескольких признаков.
Дозированность – несколько генов могут контролировать один признак. Чем больше генов, тем признак выражен ярче.
Пенетрантность – свойство генов проявляться в фенотипе.
Экспрессивность – степень фенотипического проявления гена.
Специфичность – содержит информацию об определённом белке.
Классификация генов по функциям:
Структурные
Функциональные
Структура гена прокариот.
Различают структурные гены – они содержат информацию о последовательности аминокислот в молекуле белка. Функциональные гены – регулируют работу структурных генов. Структурные гены обычно расположены рядом и образуют один блок, который называется оперон. Они отвечают за строение молекулы белка. В оперон входит промотор. Промотор – это участок молекулы ДНК, к которому присоединяется РНК – полимераза. Кроме того, промотор определяет с какой из двух цепей молекулы ДНК будет происходить транскрипция. Ген оператор – регуляторный участок. Ген терминатор – это ген расположен после структурного гена и на этом этапе заканчивается процесс транскрипции. На некотором расстоянии от оперона находится ген регулятор. Он отвечает за кодировку структуры белка репрессора.
Эукариот.
Оперон состоит из двух зон:
Неинформативная зона – состоит из двух частей. Проксимальная (акцепторная). Эта зона представлена несколькими последовательно расположенными генами промоторами и генами операторами. Дистальная (регуляторная), представлена генами регуляторами, которые ответственны за синтез белка репрессора.
Информативная зона – представлена структурными генами. Один структурный ген может повторяться многократно. Они ответственны за разные звенья одной цепи биохимических реакций. В структурных генах различают участки экзоны и интроны, которые чередуются друг с другом. В различных генах число их различно. Экзоны – кодирующая зона. Интроны – не
кодирующая зона.
У прокариот и эукариот различают гены модуляторы, которые контролируют работу оперона. К ним относятся ингибиторы или супрессоры, которые блокируют синтез белка, А также гены интенсификаторы, которые усиливают работу оперона.
Ген (др.-греч. γένος — род) — структурная и функциональная единица наследственности живых организмов. Ген представляет собой последовательность ДНК, задающую последовательность определённого полипептида либо функциональной РНК. Гены (точнее, аллели генов) определяют наследственные признаки организмов, передающиеся от родителей потомству при размножении. При этом некоторые органеллы (митохондрии, пластиды) имеют собственную, определяющую их признаки, ДНК, не входящую в геном организма.
В настоящее время, в молекулярной биологии установлено, что гены — это участки ДНК, несущие какую-либо целостную информацию — о строении одной молекулы белка или одной молекулы РНК. Эти и другие функциональные молекулы определяют развитие, рост и функционирование организма.
В то же время, каждый ген характеризуется рядом специфических регуляторных последовательностей ДНК, таких как промоторы, которые принимают непосредственное участие в регулировании проявления гена. Регуляторные последовательности могут находиться как в непосредственной близости от открытой рамки считывания, кодирующей белок, или начала последовательности РНК, как в случае с промоторами (так называемые cis-регуляторные элементы, англ. cis-regulatory elements), так и на расстоянии многих миллионов пар оснований (нуклеотидов), как в случае с энхансерами, инсуляторами и супрессорами (иногда классифицируемые как trans-регуляторные элементы, англ. trans-regulatory elements). Таким образом, понятие гена не ограничено только кодирующим участком ДНК, а представляет собой более широкую концепцию, включающую в себя и регуляторные последовательности.
Изначально термин ген появился как теоретическая единица передачи дискретной наследственной информации. История биологии помнит споры о том, какие молекулы могут являться носителями наследственной информации. Большинство исследователей считали, что такими носителями могут быть только белки, так как их строение (20 аминокислот) позволяет создать больше вариантов, чем строение ДНК, которое составлено всего из четырёх видов нуклеотидов. Позже было экспериментально доказано, что именно ДНК включает в себя наследственную информацию, что было выражено в виде центральной догмы молекулярной биологии.
Гены могут подвергаться мутациям — случайным или целенаправленным изменениям последовательности нуклеотидов в цепи ДНК. Мутации могут приводить к изменению последовательности, а следовательно изменению биологических характеристик белка или РНК, которые, в свою очередь, могут иметь результатом общее или локальное изменённое или анормальное функционирование организма. Такие мутации в ряде случаев являются патогенными, так как их результатом является заболевание, или летальными на эмбриональном уровне. Однако далеко не все изменения последовательности нуклеотидов приводят к изменению структуры белка (благодаря эффекту вырожденности генетического кода) или к существенному изменению последовательности и не являются патогенными. В частности, геном человека характеризуется однонуклеотидными полиморфизмами и вариациями числа копий (англ. copy number variations), такими как делеции и дупликации, которые составляют около 1 % всей нуклеотидной последовательности человека. Однонуклеотидные полиморфизмы, в частности, определяют различные аллели одного гена.
Мономеры, составляющие каждую из цепей ДНК, представляют собой сложные органические соединения, включающие в себя азотистые основания: аденин(А) или тимин(Т) или цитозин(Ц) или гуанин(Г), пятиатомный сахар-пентозу-дезоксирибозу, по имени которой и получила название сама ДНК, а также остаток фосфорной кислоты. Эти соединения носят название нуклеотидов.
Свойства гена.
дискретность — несмешиваемость генов;
стабильность — способность сохранять структуру;
лабильность — способность многократно мутировать;
множественный аллелизм — многие гены существуют в популяции во множестве молекулярных форм;
аллельность — в генотипе диплоидных организмов только две формы гена;
специфичность — каждый ген кодирует свой признак;
плейотропия — множественный эффект гена;
экспрессивность — степень выраженности гена в признаке;
пенетрантность — частота проявления гена в фенотипе;
амплификация — увеличение количества копий гена.
Строение гена.
Согласно современным представлениям, ген, кодирующий синтез определенного белка, у эукариот состоит из нескольких обязательных элементов. Прежде всего это обширная регуляторная зона, оказывающая сильное влияние на активность гена в той или иной ткани организма на определенной стадии его индивидуального развития. Далее расположен непосредственно примыкающий к кодирующим элементам гена промотор - последовательность ДНК длиной до 80-100 пар нуклеотидов, ответственная за связывание РНК-полимеразы, осуществляющей транскрипцию данного гена. Вслед за промотором лежит структурная часть гена, заключающая в себе информацию о первичной структуре соответствующего белка. Эта область для большинства генов эукариот существенно короче регуляторной зоны, однако ее длина может измеряться тысячами пар нуклеотидов.
Важная особенность эукариотических генов - их прерывность. Это значит, что область гена, кодирующая белок, состоит из нуклеотидных последовательностей двух типов. Одни - экзоны - это участки ДНК, которые несут информацию и строении белка и входят в состав соответствующих РНК и белка. Другие - интроны - не кодируют структуру белка и в состав зрелой молекулы и-РНК не входят, хотя и транскрибируются. Процесс вырезания интронов - «ненужных» участков молекулы РНК и сращивания экзонов при образовании и-РНК осуществляется специальными ферментами и получил название Сплайсинг (сшивание, сращивание). Экзоны обычно соединяются вместе в том же порядке, в котором они распологаются в ДНК. Однако не абсолютно все гены эукариот прерывисты. Иначе говоря, у некоторых генов, подобно бактериальным, наблюдается полное соответствие нуклеотидов последовательности первичной структуре кодируемых ими белков. Таким образом, ген эукариот во многом похож на оперон прокариот, хотя и отличается от него более сложной и протяженной регуляторной зоной, а также тем, что он кодирует обычно только один белок, а не несколько, как оперон у бактерии.
Все гены по функциям подразделяются на структурные и функциональные (рис.4.7).
Структурные гены несут информацию о белках-ферментах и гистонах, о последовательности нуклеотидов в различных видах РНК.
Среди функциональных генов выделяют:
гены-модуляторы, усиливающие или ослабляющие действие структурных генов (супрессоры (ингибиторы), активаторы, модификаторы);
гены, регулирующие работу структурных генов (регуляторы и операторы).
Все клетки многоклеточного организма, возникая из зиготы путем митоза, получают полноценный набор генетической информации. Несмотря на это, они отличаются друг от друга по морфологии, биохимическим и функциональным свойствам. В основе этих различий лежит активное функционирование в разных клетках неодинаковых частей генома. Большая часть генома находится в клетках организма в неактивном, репрессированном, состоянии, и только 7-10% генов активны, т. е. транскрибируются. Спектр функционирующих генов зависит от тканевой принадлежности клетки, от
периода ее жизненного цикла и стадии индивидуального развития организма.
Основная масса генов, активно функционирующих в большинстве клеток организма на протяжении онтогенеза,- это гены «домашнего хозяйства», которые обеспечивают синтез белков общего назначения (белки рибосом, гистоны, тубулины и т. д.), тРНК и рРНК. Транскрибирование этих генов обеспечивается соединением РНК-полимеразы с их промоторами и, видимо, не подчиняется каким-либо другим регулирующим воздействиям. Такие гены называют конститутивными .
Другая группа генов, детерминирующих синтез специфических продуктов, в своем функционировании зависит от различных регулирующих факторов, ее называют регулируемыми генами. Они функционируют только в определенных клетках и тканях и называются генами «роскоши». Изменение условий может привести к активации «молчащих» генов и репрессии активных. Дифференцированная экспрессия одного генома у млекопитающих обусловливает развитие огромного множества типов клеток.
Глава 5 Особенности структурной и функциональной организации генов про- и эукариот. Регуляция экспрессии генов у про- и эукариот. Реализация генетической информации. Биосинтез белка
Наследственность и изменчивость - важнейшие свойства любой живой системы, обеспечиваются функционированием особого материального субстрата. Как же он устроен?
Первые предположения об организации наследственного материала высказал основоположник генетики Г.Мендель. В своей работе “Опыты над растительными гибридами ” на основании результатов проведенных экспериментов на горохе он пришел к заключению, что наследственный материал дискретен, т.е. представлен отдельными наследственными задатками, отвечающими за развитие определенных признаков. Понятия «ген» в то время еще не существовало. Только в 1909 году В. Иогансен назвал «наследственные задатки» Менделя генами.
Что же такое ген? Следует сразу оговориться, что до сих пор не существует достаточно полного и всеобъемлющего определения понятия ген, оно эволюционировало вместе с познанием его структуры и функции.
Долгое время ген рассматривали как минимальную часть наследственного материала, обеспечивающую развитие определенного признака, что выражалось формулой «1 ген-1 признак». Это понятие классической генетики ХХ века. Между тем, какова структура гена, как он функционирует оставалось неясным. В 1945 г. Бидл и Татум установили, что гены отвечают за образование определенных ферментов, которые затем оказывают влияние на развитие тех или иных признаков. Эту гипотезу можно выразить формулой «1 ген-1 фермент» или «1 ген-1 белок».
Однако позднее было показано, что многие белки имеют четвертичную структуру, в образовании которой принимают участие разные пептидные цепи. Например, гемоглобин взрослого человека включает 4 глобиновые цепи - 2 альфа и 2 бетта, которые кодируются совершенно разными генами. Поэтому формула гена была преобразована: «1 ген – 1 полипептид» .
Но в дальнейшем открытие особенностей структурной организации генов показало, что одна и та же последовательность (т.е. ген) может обеспечивать синтез нескольких разных полипептидных цепей с разными функциями. Так, у человека примерно 100.000 белков и всего 30.000 генов, т.е. большинство генов несут информацию о нескольких полипептидах. Стало понятно, что нельзя говорить о гене как об участке генома, кодирующем только 1 полипептидную цепь. Кроме того, в гене
Оперон
Рис. 5.2. Схема регуляции экспрессии генов у прокариот (А - Белок-репрессор блокирует оператор, Б - Индуктор связывает белок-репрессор. Оператор освобождается. РНК-полимераза осуществляет транскрипцию).
зашифрована информация не только о каком-то белке, но и об РНК (н-р, тРНК). Таким образом, в настоящее время определение гена следующее:
Ген –это фрагмент ДНК, ассоциированный с регуляторными элементами и соответствующий одной единице транскрипции, которая определяет возможность синтеза полипептидной цепи или молекулы РНК.
Реализация наследственной информации, заключенной в генотипе организма,- это сложный процесс, который требует тонкой регуляции для того, чтобы в клетках разной тканевой принадлежности в определенное время в процессе развития организма обеспечить синтез специфических белков в необходимом количестве (рис. 5.1). Рассмотрим основные закономерности экспрессии (функционирования) генов.
8.1. Ген как дискретная единица наследственности
Одним из фундаментальных понятий генетики на всех этапах ее развития было понятие единицы наследственности. В 1865 году основоположник генетики (науки о наследственности и изменчивости) Г. Мендель на основании результатов своих опытов на горохе пришел к заключению, что наследственный материал дискретен, т.е. представлен отдельными единицами наследственности. Единицы наследственности, которые отвечают за развитие отдельных признаков, Г.Мендель назвал «задатками». Мендель утверждал, что в организме по любому признаку имеется пара аллельных задатков (по одному от каждого из родителей), которые между собой не взаимодействуют, не смешиваются и не изменяются. Поэтому, при половом размножении организмов в гаметы попадает лишь один из наследственных задатков в «чистом» неизменном виде.
Позже предположения Г.Менделя о единицах наследственности получили полное цитологическое подтверждение. В 1909 году датский генетик В. Иогансен назвал «наследственные задатки» Менделя генами.
В рамках классической генетики ген рассматривается как функционально неделимая единица наследственного материала, определяющая формирование какого-либо элементарного признака.
Различные варианты состояния определенного гена, возникшие в результате изменений (мутаций), получили название «аллели» (аллельные гены). Количество аллелей гена в популяции может быть значительным, но у конкретного организма число аллелей определенного гена всегда равно двум – по числу гомологичных хромосом. Если в популяции количество аллелей какого-либо гена больше двух, то такое явление получило название «множественного аллелизма».
Гены характеризуются двумя противоположными по биологическому значению свойствами: высокой стабильностью своей структурной организации и способностью к наследственным изменениям (мутациям). Благодаря этим уникальным свойствам обеспечивается: с одной стороны – устойчивость биологических систем (неизменяемость в ряде поколений), а с другой – процесс их исторического развития, формирования адаптаций к условиям окружающей среды, т.е. эволюция.
8.2. Ген как единица генетической информации. Генетический код.
Еще Аристотель более 2500 лет тому высказал предположение о том, что гаметы – это отнюдь не миниатюрные варианты будущего организма, а структуры, содержащие информацию о развитии эмбрионов (хотя он признавал только исключительно важность яйцеклетки в ущерб сперматозоиду). Однако развитие этой идеи в современных исследованиях стало возможным лишь после 1953 года, когда Дж. Уотсон и Ф. Крик разработали трехмерную модель строения ДНК и тем самым создали научные предпосылки для раскрытия молекулярных основ наследственной информации. С этого времени началась эра современной молекулярной генетики.
Развитие молекулярной генетики привело к раскрытию химической природы генетической (наследственной) информации и наполнило конкретным смыслом представление о гене как единици генетической информации.
Генетическая информация – информация о признаках и свойствах живых организмов, заложенная в наследственных структурах ДНК, которая реализуется в онтогенезе через синтез белка. Наследственную информацию, как программу развития организма, каждое новое поколение получает от предков в виде совокупности генов генома. Единицей наследственной информации является ген, который представляет собой функционально неделимый участок ДНК со специфической последовательностью нуклеотидов, определяющей последовательность аминокислот определенного полипептида или нуклеотидов РНК.
Наследственная информация о первичной структуре белка записана в ДНК с помощью генетического кода.
Генетический код – система записи генетической информации в молекуле ДНК (РНК) в виде определенной последовательности нуклеотидов. Этот код служит ключом для перевода последовательности нуклеотидов в и-РНК в последовательность аминокислот полипептидной цепи при ее синтезе.
Свойства генетического кода:
1. Триплетность – каждая аминокислота кодируется последовательностью из трех нуклеотидов (триплетом или кодоном)
2. Вырожденность – большинство аминокислот шифруется более чем одним кодоном (от 2 до 6). В ДНК или РНК имеется 4 различных нуклеотида, которые теоретически могут образовывать 64 разных триплета (4 3 = 64) для кодирования 20 аминокислот, входящих в состав белков. Этим и объясняется вырожденность генетического кода.
3. Неперекрываемость – один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух соседних триплетов.
4. Специфичность (однозначность) – каждый триплет кодирует только одну аминокислоту.
5. Код не имеет знаков препинания. Считывание информации с и-РНК при синтезе белка всегда идет в направлении 5 , -- 3 , в соответствии с последовательностью кодонов иРНК. Если произойдет выпадение одного нуклеотида, то при считывание его место займет ближайший нуклеотид из соседнего кода, из-за чего изменится аминокислотный состав в молекуле белка.
6. Код универсален для всех живых организмов и вирусов: одинаковые триплеты кодируют одинаковые аминокислоты.
Универсальность генетического кода свидетельствует о единстве происхождения всех живых организмов
Однако, универсальность генетического кода не является абсолютной. В митохондриях ряд кодонов имеет другой смысл. Поэтому иногда говорят о квазиуниверсальности генетического кода. Особенности генетического кода митохондрий свидетельствует о возможности его эволюционирования в процессе исторического развития живой природы.
Среди триплетов универсального генетического кода три кодона не кодируют аминокислоты и определяют момент окончания синтеза данной полипептидной молекулы. Это так называемые «nonsens» кодоны (стоп-кодоны или терминаторы). К ним относятся: в ДНК – АТТ, АЦТ, АТЦ; в РНК – УАА, УГА, УАГ.
Соответствие нуклеотидов в молекуле ДНК порядку аминокислот в молекуле полипептида получило название коллинеарности. Экспериментальное подтверждение коллинеарности сыграло решающую роль в расшифровке механизма реализации наследственной информации.
Значение кодонов генетического кода приведены в таблице 8.1.
Табл.8.1. Генетический код (кодоны иРНК для аминокислот)
С помощью этой таблицы по кодонам иРНК можно определить аминокислоты. Первый и третий нуклеотиды берут из вертикальных столбиков, расположенных справа и слева, а второй – с горизонтального. В месте перессичения условных линий содержится информация про соответствующую аминокислоту. Отметим, что в таблице приводится триплеты и-РНК, а не ДНК.
Структурно - функциональная организация гена
Молекулярная биология гена
Современное представление о строении и функции гена формировалось в русле нового направления, которое Дж.Уотсон назвал молекулярной биологией гена (1978)
Важным этапом в изучении структурно – функциональной организации гена были работы С. Бензера в конце 1950-хх годов. Они доказали, что ген представляет собой нуклеотидную последовательность, которая может изменятся в результате рекомбинаций и мутаций. Единицу рекомбинации С.Бензер назвал реконом, а еденицу мутации – мутоном. Экспериментально установлено, что мутон и рекон соответствуют одной паре нуклеотидов. Единицу генетической функции С. Бензер назвал цистроном.
В последние годы стало известно, что ген имеет сложное внутренее строение, а отдельные его части обладают разными функциями. В гене можно выделить последовательность нуклеотидов гена, которая определяет строение полипептида. Эта последовательность называется цистроном.
Цистрон – это последовательность нуклеотидов ДНК, которая определяет отдельную генетическую функцию полипептидной цепи. Ген может быть представлен одним или несколькими цистронами. Сложные гены содержащие в себе несколько цистронов называются полицистронными .
Дальнейшее развитие теории гена связано с выявлением различий в организации генетического материала у организмов далеких друг от друга в таксономическом отношении, которыми являются про- и эукариоты.
Структура генов прокариот
У прокариот, типичными представителями которых являются бактерии, большинство генов представлены непрерывными информативными участками ДНК, вся информация которых используется при синтезе полипептида. У бактерий гены занимают 80-90% ДНК. Главная особенность генов прокариот – это их объединение в группы или опероны.
Оперон – это группа следующих подряд структурных генов, находящихся под контролем одного регуляторного участка ДНК. Все сцепленые гены оперона кодируют ферменты одного метаболического пути (например, расщепление лактозы). Такая общая молекула иРНК называется полицистронной. Только некоторые гены прокариот транскрибируются индивидуально. Их РНК называется моноцистронной.
Организация по типу оперона позволяет бактериям быстро переключать метаболизм с одного субстрата на другой. Бактерии не синтезируют ферменты определенного метаболического пути в отсутствии необходимого субстрата, но способны начать их синтезировать при появлении субстрата.
Структура генов эукариот
Большинство генов эукариот (в отличии от генов прокариот) имеют характерную особенность: содержат не только кодирующие структуру полипептида участки – экзоны, но и некодирующие – интроны. Интроны и экзоны чередуются между собой, что придает гену прерывистую (мозаичную) структуру. Количество интронов в генах варьиирует от 2-х до десятков. Роль интронов до конца неясна. Полагают, что они учавствуют в процессах рекомбинации генетического материала, а также в процессах регуляции экспресии (реализации генетической информации) гена.
Благодаря экзонно – интронной организации генов создаются предпосылки для альтернативного сплайсинга. Альтернативний сплайсинг- процесс «вырезания» разных интронов из первичного РНК-транскрипта в результате чего на основе одного гена могут синтезироватся разные белки. Явление альтернативного сплайсинга имеет место у млекопитающих при синтезе различних антител на основе иммуноглобулиновых генов.
Дальнейшие исследование тонкой структуры генетического материала еще больше осложнило четкость определения понятия «ген». В геноме эукариот были обнаружены обширные регуляторные области имеющие различные участки, которые могут располагатся за пределами едениц трансскрипции на расстоянии в десятки тысяч пар нуклеотидов. Структуру эукариотического гена, включающую транскрибируемые и регуляторные области, можно представить следующие образом.
Рис 8.1. Структура эукариотического гена
1 – энхансеры; 2 – сайленсеры; 3 – промотор; 4 – экзоны; 5 – интроны; 6 – участки экзонов, кодирующие нетранслируемые области.
Промотор – участок ДНК для связывания с РНК – полимеразой и образование комплекса ДНК-РНК полимеразы для запуска синтеза РНК.
Энхансеры - усилители транскрипции.
Сайленсеры – ослабители транскрипции.
В настоящее время ген (цистрон) рассматривается как функционально неделимая единица наследственного мастерства, определяющая развитие какого – либо признака или свойства организма. С позиции молекулярной генетики ген представляет собой участок ДНК (у некоторых вирусов РНК), который несет информацию о первичной структуре полипептида, молекулы транспортной и рибосомальной РНК.
В диплоидных клетках человека примерно 32000 пар генов. Большинство генов в каждой клетке «молчит». Набор активных генов зависит от типа ткани, периода развития организма, полученных внешних или внутренних сигналов. Можно сказать, что в каждой клетке «звучит» свой акорд генов, определяя спектр синтезируемых РНК, белков и, соответственно, свойства клетки.
Структура генов вирусов
Вирусы имеют структуру гена, отражающую генетическую структуру клетки - хозяина. Так, гены бактериофагов собраны в опероны и не имеют интронов, а вирусы эукариот имеют интроны.
Характерная особенность вирусных геномов – это явление «перекрывающихся» генов («ген в гене»). В «перекрывающихся» генах каждый нуклеотид принадлежит одному кодону, но имеются разные рамки считывание генетической информации с одной и той же нуклеотидной последовательности. Так, у фага φ Х 174 имеется участок молекулы ДНК, который входит в состав сразу трех генов. Но соответствующие этим генам последовательности нуклеотидов прочитывается каждая в своей системе отсчета. Поэтому нельзя говорить о «перекрывании» кода.
Такая организация генетического материала («ген в гене») расширяет информационные возможности сравнительно небольшого по величине генома вирусов. Функционирование генетического материала вирусов происходит по-разному в зависимости от структуры вируса, но всегда с помощью ферментной системы клетки хозяина. Различные способы организации генов у вирусов, про- и эукариотов представлены на рис 8.2.
Функционально – генетическая классификация генов
Существует несколько классификаций генов. Так, например, выделяют аллельные и неаллельные гены, летальные и полулетальные, гены «домашнего хозяйства», «гены роскоши» и т.д.
Гены «домашнего хозяйства» - набор активных генов, необходимых для функционирования всех клеток организма независимо от типа ткани, периода развития организма. Эти гены кодируют ферменты транскрипции, синтеза АТФ, репликации, репарации ДНК и др.
Гены «роскоши» имеют избирательную активность. Их функционирование специфично и зависит от типа ткани, периода развития организма, полученных внешних или внутренних сигналов.
Исходя из современных представлений о гене как функционально неделимой единице наследственного материала и системной организации генотипа все гены принципиально можно разделить на две группы: структурные и регуляторные.
Регуляторные гены – кодируют синтез специфических белков, влияющих на функционирование структурных генов таким образом, что в клетках разной тканевой принадлежности синтезируются необходимые белки и в необходимых количествах.
Структурными называются гены, которые несут информацию о первичной структуре белка, рРНК или тРНК. Гены, кодирующие белки, несут информацию о последовательности аминокислот определенных полипептидов. С этих участков ДНК транскребируется иРНК, которая служит матрицей для синтеза первичной структуры белка.
Гены рРНК (выделяют 4 разновидности) содержат информацию о последовательности нуклеотидов рибосомальных РНК и обуславливают их синтез.
Гены тРНК (более 30 разновидностей) несут информацию о строении транспортных РНК.
Структурные гены , функционирование которых тесно связано со специфическими последовательностями в молекуле ДНК, называемыми регуляторными участками, подразделяются на:
· независимые гены;
· повторяющиеся гены;
· кластеры генов.
Независимые гены – это гены, транскрипция которых не связана с транскрипцией других генов в рамках транскрипционной еденицы. Их активность может регулироваться экзогенными веществами, например, гормонами.
Повторяющиеся гены присутствуют в хромосоме в виде повторов одного гена. Ген рибосомной 5-S-РНК повторяется много сотен раз, причем повторы располагаются тандемом, т. е. следуя вплотную друг за другом без промежутков.
Кластеры генов – это локализованные в определенных участках (локусах) хромосомы группы разных структурных генов с родственными функциями. Кластеры тоже часто присутствуют в хромосоме в виде повторов. Например, кластер гистоновых генов повторяется в геноме человека 10-20 раз, обазуя тандемную групу повторов.(рис. 8.3.)
Рис.8.3. Кластер гистоновых генов
За редким исключением кластеры транскрибируются как одно целое – в виде одной длинной пре-мРнк. Так пре-мРНК кластера гистоновых генов содержит информацию про все пять гистоновых белков. Это ускоряет синтез гистоновых белков, которые принимают участие в формировании нуклеосомной структуры хроматина.
Существуют также сложные кластеры генов, которые могут кодировать длинные полипептиды с несколькими ферментативными активностями. Например, один из генов NeuraSpora grassa кодирует полипептид с молекулярной масой 150000 дальтон, который отвечает за 5 последовательных этапов в биосинтезе ароматических аминокислот. Полагают, что полифункциональные белки имеют несколько доменов – конформационно ограниченных полуавтономных образований в полипептидной цепи, выполняющих специфические функции. Открытие полуфункциональных белков дало основание полагать, что они являются одним из механизмов плейотропного действия одного гена на формирование нескольких признаков.
В кодирующей последовательности этих генов могут вклиниваться некодирующие, называемые интронами. Кроме того между генами могут находится участки спейсерной, и сателитной ДНК (рис.8.4).
Рис.8.4. Структурная организация нуклеотидных последовательностей (генов) в ДНК.
Спейсерная ДНК располагается между генами и не всегда транскрибируется. Иногда участок такой ДНК между генами (так называемый спейсер) содержит какую-то информацию, относящуюся к регуляции транскрипции, но он может представлять собой и просто короткие повторяющиеся последовательности избыточной ДНК, роль которой остается неясной.
Сателитная ДНК содержит большое количество групп повторяющихся нуклеотидов, которые не имеют смысла и не транскрибируются. Эта ДНК часто располагается в области гетерохроматина центромер митотических хромосом. Одиночные гены среди сателитной ДНК имеет регулирующие и усиливающие действие на структурные гены.
Большой теоритический и практический интерес для молекулярной биологии и медицинской генетики представляет микро- и минисателитные ДНК.
Микросателитная ДНК – короткие тандемные повторы из 2-6, (чаще из 2-4) нуклеотидов, которые получили название STR. Наиболее распространенными являются нуклеотидные ЦА- повторы. Количество повторов может существенно различатся у разных людей. Микросателиты находятся преимущественно в некоторых участках ДНК и насследуются по законам Менделя. Ребенок получают одну хромосому от матери, с определенным количеством повторов, другую от отца - с другим количеством повторов. Если рядом с геном ответственным за моногенное заболевание, или внутри гена расположен такой кластер микросателитов, то маркером патологического гена может быть определенное количество повторов по длине кластера. Эта особенность используется при непрямой диагностике генных болезней.
Минисателитная ДНК – тандемные повторы из 15-100 нуклеотидов. Они получили название VNTR – вариабельные по количеству тандемные повторы. Длина этих локусов также существено вариабельна у разных людей и может быть маркером (меткой) патологического гена.
Микро- и макросателитные ДНК используют:
1. Для диагностики генных болезней;
2. В судебно-медицинской экспертизе для идентификации личностей;
3. Для установления отцовства и в других ситуациях.
Наряду со структурными и регуляторными повторяющимися последовательностями, функции которых неизвестны, обнаружены мигрирующие нуклеотидные последовательности (транспозоны, мобильные гены), а также так называемые псевдогены у эукариот.
Псевдогены – нефункционирующие последовательности ДНК, которые сходные с функционирующими генами.
Вероятно, они произошли путем дупликации, а неактиаными копии стали в результате мутаций, нарушивших какие-либо стадии экспрессии.
По одной из версий псевдогены являются «эволюционным резервом»; по-другой – представляют собой «тупики эволюции», побочный эффект перестроек некогда функционирующих генов.
Транспозоны - структурно и генетически дискретные фрагменты ДНК, способные перемещаться от одной молекулы ДНК к другой. Впервые предсказаны Б.Мак-Клинток (рис. 8) в конце 40-х годов XX века на основе генетических экспериментов на кукурузе. Изучая природу окраски зерен кукурузы она сделала предположение, что существуют так званые мобильные („прыгающее”) гены, которые могут перемещаться по геному клетки. Пребывая по соседству с геном ответственным за пигментацию зерен кукурузы мобильные гены блокируют его работу. В дальнейшем транспозоны были выявлены у бактерий и было установлено, что они ответственны за устойчивость бактерий к различным токсическим соединениям.
Рис. 8.5. Барбара Мак- Клинток Впервые предсказала о существовании мобильных («прыгающих») генов, способных перемещаться по геному клеток.
Мобильные генетические элементы выполняют такие функции:
1. кодируют белки, ответственные за их перемещение и репликацию.
2. вызывают многие наследственные изменения в клетках, вследствии чего образуется новый генетический материал.
3. приводит к образованию раковых клеток.
4. встраиваясь в различные участки хромосом, они инактивируют или усиливают экспрессию клеточных генов,
5. является важным фактором биологической эволюции.
Современное состояние теории гена
Современные теории гена сформирована благодаря переходу генетики на молекулярный уровень анализа и отражает тонкую структурно-функциональную организацию единиц насследственности. Основные положения этой теории следующие:
1) ген(цистрон) – функциональная неделимая еденица наследственного материала (ДНК у организмов и РНК у некоторых вирусов), определяющая проявление наследственного признака или свойства организма.
2) Большинство генов существует в виде двух или большего числа альтернативных (взаимоисключающих) вариантов аллелей. Все аллели данного гена локализуются в одной и той же хромосоме в определенном ее участке, которую назвали локусом.
3) Внутри гена могут происходить изменения в виде мутаций и рекомбинаций; минимальные размеры мутона и рекона равны одной паре нуклеотидов.
4) Существуют структурные и регуляторные гены.
5) Структурные гены несут информацию о последовательности аминокислот в определенном полипептиде и нуклеотидов в рРНК, тРНК
6) Регуляторные гены контролируют и направляют роботу структурных генов.
7) Ген не принимает непосредственного участия в синтезе белка, он является матрицей для синтеза различных видов РНК, которые непосредственно принимают участие в синтезе белка.
8) Существует соответствие (колиннеарность) между расположением триплетов из нуклеотидов в структурных генах и порядком аминокислот в молекуле полипептида.
9) Большинство мутаций гена не проявляются в фенотипе, так как молекулы ДНК способны к репарации (востановлению своей нативной структуры)
10) Генотип являет собой систему, которая состоит из дискретных едениц – геннов.
11) Фенотическое проявление гена зависит от генотипической среды, в которой находится ген, влияние факторов внешней и внутренней среды.
Фундаментальным понятием в генетике является представление о гене как единице наследственности. Ниже приводится два определения гена. Ген - это участок ДНК, коллинеарно кодирующий определённый белковый или нуклеиновый продукт. Ген - это фрагмент 2-цепочечной ДНК, несущей определённую генетическую информацию. У кишечной палочки имеется 4 тыс. генов, у дрожжей - 7 тыс. генов, а у дрозофилы и плоских червей -15-20 тысяч генов,У человека имеется приблизительно от 50 тысяч до 100 тысяч структурных генов, по данным на 1989 год около 5 тысяч генов были приблизительно охарактеризованы, а около 2 тысяч генов были нанесены на карты хромосом (картированы). 26 июня 2000 года в прессе было сделано сообщение о том, что учеными США, Англии, Японии и других стран, участвующими в программе «Геном человека», завершена основная часть работы (более 90%) по расшифровке генетического кода человека.
В ближайшие 2 года планируется уточнить и завершить работу по данной программе, которая имеет важное прикладное значение для медицины. В плане данной темы важно помнить, что ген занимает определённый участок (локус) в хромосоме, это участок ДНК, который может быть представлен десятками, сотнями или тысячами пар нуклеотидов. В настоящее время, с функционально-генетической точки зрения, гены классифицируют на 3 группы:
- 1. Структурные гены - кодируют структуру синтезируемых клеткой белков (структурных белков, белков-ферментов и др.), а также кодируют последовательности нуклеотидов в молекулах т-РНК и р-РНК.
- 2. Регуляторные (функциональные) гены - контролируют и направляют работу структурных генов.
- 3. Гены-модуляторы. К ним относятся гены-ингибиторы (или супрессоры), которые подавляют функции других генов, гены-интенсификаторы, которые усиливают функции других генов и др. Экзонно-интронная структура генов.
В 70-х годах XX века было обнаружено, что структурные гены эукариот содержат экзоны (участки ДНК, несущие генетическую информацию и отвечающие за синтез определенных участков белков) и интроны (участки ДНК, которые не несут генетической информации, относящейся к синтезу белка, кодируемого данным геном). Интроны ещё называют вставками, расположенными между экзонами. Таким образом, принципиальным отличием генов эукариот от генов прокариот является то, что их структурные гены имеют разорванную, прерывистую структуру. Однако исключение составляют гены, кодирующие гистоны и интерфероны, они не содержат интронов. Дальнейшие исследования показали, что большинство генов эукариот имеют экзон-интронную организацию. Длина интронов варьирует в очень широких пределах: от 100 до 10000 нуклеотидов и более, нередко их суммарная длина больше длины экзонов. Количество интронов и экзонов в разных генах варьирует. Один из самых коротких - ген бета-глобина, состоящий из 1100 пар нуклеотидов (пн), содержит 3 экзона (90, 222, 126 пн) и 2 интрона (116, 646 пн). Примером протяженного гена служит ген дистрофина, имеющий 2,6 млн пн и более 2000 экзонов.
Представление, что интроны - нефункциональная часть гена, - неверно. И хотя детально их биологическая роль не выяснена, существует ряд гипотез о значении интронов:
1) Строение генов из участков выгодно для процессов генетической рекомбинации, перетасовки генов. Чем дальше в хромосоме расположены фрагменты генетического материала, тем выше вероятность рекомбинации. Именно поэтому и выгодны вставки-интроны. Нуклеотидная последовательность интронов менее консервативна, чем у экзонов, она подвергается быстрым изменениям в эволюции.
Перетасовка частей генов может быть использована для разных целей: а) это путь к образованию новых генов; б) это способ нейтрализации вредных мутаций.
2) Предполагается регуляторная роль интронов в экспрессии (работе) генов. Интроны могут содержать энхансеры. Они могут кодировать особый фермент, который участвует в сплайсинге м-РНК (смотри следующий вопрос). Заканчивая разговор о гене, необходимо отметить ещё одно обстоятельство. У эукариот гены разделены между собой протяженными участками ДНК, которые были названы спейсерами, или разделителями. Накапливается всё более данных, что именно в спейсерах располагаются те сегменты ДНК, которым принадлежит решающая роль в регуляции работы генов (в регуляции транскрипции). Регуляиия биосинтеза белка у прокариот (на примере работы лактозного оперона кишечной папочки).
Все клетки любого организма имеют полный набор свойственных данному организму генов. Вместе с тем известно, что клетки разных тканей и органов отличаются по набору имеющихся в них белков. Располагая полной генетической информацией, каждая клетка на определенном этапе развития использует лишь ту её часть, которая необходима в настоящий момент, транскрибируются («работают») только те гены, продукты которых нужны клетке в данный момент для выполнения её функций. Следовательно, клетка должна обладать механизмами, определяющими какие гены и в какой последовательности должны транскрибироваться. Наиболее полно регуляция генной активности изучена на примерах синтеза белков-ферментов у микроорганизмов.
Теория регуляции биосинтеза белка у прокариот разработана в 50-х годах XX века французскими учеными Ф. Жакобом и Ж. Моно. Они разработали концепцию опреона и выяснили основные принципы регуляции биосинтеза белка у прокариот. Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моно, гены функционально неодинаковы: выделяют группу структурных генов (они кодируют структуру синтезируемых клеткой попипептидов, белков, р-РНК, т-РНК) и группу регуляторных генов (они управляют работой структурных генов обычно с помощью присоединения к ним различных белковых факторов).
Единицей генетической регуляции является оперон, который представляет собой совокупность расположенных е линейной последовательности регуляторных и одного или нескольких структурных генов. Гены одного оперона расположены в хромосоме прокариот рядом и кодируют ферменты, осуществляющие последовательные реакции синтеза или расщепления. Эти гены находятся под общим регуляторным контролем и могут включаться и выключаться координированно. Одним из наиболее наглядных и хорошо изученных примеров является лактозный оперон кишечной палочки (Escherichia coli) - группа генов, контролирующая синтез ферментов, осуществляющих катаболизм молочного сахара - лактозы. Буквально через несколько минут после добавления в питательную среду для кишечной палочки лактозы, бактерии начинают вырабатывать 3 фермента: галактозидпермеазу, бетагалактозидазу и галактоэидтрансацетилазу. Как только ресурсы лактозы в среде исчерпываются, синтез ферментов сразу же прекращается.
Строение лактозного оперона кишечной палочки:
- 1. Начинается оперон с участка А - он предназначен для присоединения белка-активатора (синий круглешок), в свою очередь необходимого для присоединения к следующему участку фермента (РНК-полимеразы).
- 2. Следующий участок П (промотор) - место прикрепления фермента РНК-полимеразы (зеленый треугольник), это участок начала транскрипции.
- 3. За промотором следует О (оператор) - он играет важную роль в транскрипции генов оперона, т.к. с ним может прикрепляться регуляторный белок-репрессор (красн 2 треугольника)
- 4. За оператором следуют структурные гены (z, у, а), которые кодируют построение 3-х упомянутых ранее белков-ферментов.
- 5. Заканчивается оперон Т (терминатором) - участком, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипции оперона.
- 6. Основная регуляция работы структурных генов осуществляется регуляторным белком (красн 2 треугольн) который кодируется Р (геном-регулятором), который не входит в состав оперона, а лежит поблизости в другом месте хромосомы.
Работа лактозного оперона Регуляторный белок-репрессор в незначительном количестве синтезируется в клетке постоянно. Этот белок обладает сродством к последовательности нуклеотидов в области оператора, а также сродством к лактозе. Репрессия: В отсутствие лактозы регуляторный белок связывается с участком-оператором (О) и препятствует продвижению по ДНК РНК-полимеразы: не синтезируется м-РНК, не синтезируются и белки-ферменты. Индукция: После добавления в среду лактозы, регуляторный белок связывается с ней быстрее, чем с участком-оператором, который остаётся свободным и не препятствует продвижению РНК-полимеразы. Идёт транскрипция и трансляция. Синтезирующие белки-ферменты расщепляют лактозу. После того, как вся лактоза будет израсходована, нечем будет связывать регуляторный белок и он снова окажется с О (оператором), прекратив транскрипцию оперона.
Другой известный тип индукции - позитивная индукция. Она свойственна другому оперону кишечной палочки, кодирующему ферменты катаболизма другого сахара - арабинозы. Этот оперон структурно очень похож на предыдущий. Разница в регуляции состоит в том, что добавленная в среду арабиноза взаимодействует с белком-репрессороми, освобождая операторный участок, одновременно превращает белок-репрессор в белок-активатор, способствующий. присоединению РНК-полимеразы к промотору. В этих условиях транскрипции имеет место. Как только запасы арабинозы в среде исчерпываются, синтезирующийся белок-репрессор опять связывается с оператором, выключая транскрипцию.
Кроме индукции, известны также 2 типа (негативный и позитивный) регуляции по принципу репрессии. Если при негативной индукции эффектор (индуктор) препятствует присоединению белка-репрессора к оператору, то при негативной репрессии, наоборот, эффектор придаёт регуляторному белку способность присоединяться к оператору. Если в первом случае соединение эффектора с белком-регулятором разрешало транскрипцию, то во втором оно запрещает её. Примером негативной репрессии может служить хорошо изученный триптофановый оперон кишечной палочки.
В его состав входят пять структурных генов, обеспечивающих синтез аминокислоты триптофана, оператор и два промотора. Белок-регулятор синтезируется вне триптофонового оперона. Пока клетка успевает расходовать весь синтезирующийся триптофан, оперон работает, синтез триптофана продолжается. Если же в клетке появляется избыток триптофана, он соединяется с регуляторным белком и изменяет его таким образом, что этот белок приобретает сродство с оператором. Измененный белок-регулятор взаимодействует с оператором и препятствует транскрипции структурных генов вследствии чего синтез триптофана прекращается. При позитивной репрессии эффектор лишает регуляторный белок способности связываться с оператором, обуславливая таким образом, транскрипцию структуоных генов.
Описанные типы регуляции характеризуют механизмы регуляции отдельных оперонов, практически не касаясь регуляции экспрессии генома в целом, в то время как совершенно очевидно, что регуляция разных оперонов должна носить согласованный характер. Такой согласованный характер работы разных оперонов и генов получил у вирусов и фагов название каскадной регуляции. Согласно принципу каскадной регуляции, сначала происходит транскрипция «предранних», затем «ранних» и наконец «поздних» генов, в зависимости от того, какие белки требуются на разных стадиях вирусной (фаговой) инфекции.
Конечно, принцип каскадной регуляции у фагов относится к наиболее простым. У более сложно организованных организмов для осуществления большого количества функций, происходящих одновременно или с определённой последовательностью, необходима согласованная работа многих генов и оперонов, Особенно это касается эукариотов, отличающихся не только более сложной организацией генома, но и многими другими особенностями механизмов регуляции генной активности.
По принципам регуляции гены эукариотов можно условно разделить на 3 группы:
- 1) функционирующие во всех клетках организма;
- 2) функционирующие в тканях только одного типа;
- 3) обеспечивающие выполнение специализированными клетками конкретных функций.
Кроме того, у эукариотов известно одновременное групповое выключение генной активности, осуществляемое гистонами - основными белками, входящими в состав хромосом. Ещё одним существенным отличием транскрипции у эукариотов является то, что многие м-РНК длительное время сохраняются в клетке в виде особых частиц -информосом, в то время как м-РНК прокариотов практически ещё в процессе транскрипции поступают в рибосомы, транслируются, после чего быстро разрушаются.
Вместе с тем, имеется много данных, указывающих, что транскрипция у эукариотов осуществляется с участков, подобных оперонам прокариотов и состоящих из регуляторных и структурных генов. Отличительной особенностью оперонов эукариотов является то, что почти всегда они содержат только структурный ген, а гены, контролирующие различные этапы определённой цепи метаболических превращений разбросаны по хромосоме и даже по разным хромосомам.
Другой отличительной чертой оперонов эукариотов является то, что они состоят из значащих (экзонов) и незначащих (интронов) участов. чередующихся друг с другом. При транскрипции считываются как экзоны, так и интроны, а образующийся при этом предшественник информационной РНК (про-мРНК) затем претерпевает созревание (процессинг), в результате которого происходит вырезание интронов и образование собственно м-РНК (сплайсинг).
У эукариотов известны и другие типы регуляции активности генов, такие как эффект положения или дозовая компенсация. В первом случае речь идёт об изменении генной активности е зависимости от конкретного окружения: перемещение гена из одного места хромосомы в другое может приводить к изменению активности как этого гена, так и близлежащих. Во втором случае, нехватка одной дозы какого-либо гена (в первую очередь это относится к генам, локализованным в половых хромосомах гетерогаметного пола, когда одна из гомологичных половых хромосом либо генетически инертна, либо полностью отсутствует) фенотипически не проявляется за счет компенсаторного увеличения активности оставшегося гена, В целом же, регуляция активности генов у эукариотов изучена недостаточно.
